ViaStain™ AO/PI Viability Stains

AO/PI-Färbelösung: Zur genauen Bestimmung der Konzentration lebender / toter kernhaltiger Zellen in heterogenen Proben mittels Dual-Fluoreszenz.

Die Dual-Fluoreszenz-Viabilität unter Verwendung von Acridinorange (AO) und Propidiumiodid (PI) ist die empfohlene Methode für die genaue Viabilitätsanalyse von Primärzellen, wie z. B. PBMCs, Splenozyten und Stammzellen in Proben, die Trümmer und unerwünschte nicht kernhaltige Zelltypen, einschließlich roter Blutkörperchen, enthalten.

Acridinorange (AO) und Propidiumjodid (PI) sind Farbstoffe zur Kernfärbung (Nukleinsäurebindung). AO ist sowohl für lebende als auch für tote Zellen durchlässig und färbt alle kernhaltigen Zellen, um grüne Fluoreszenz zu erzeugen. PI dringt in tote Zellen mit beschädigten Membranen ein und färbt alle toten kernhaltigen Zellen, um rote Fluoreszenz zu erzeugen. Zellen, die sowohl mit AO als auch mit PI angefärbt wurden, fluoreszieren aufgrund des Quenching rot, so dass alle lebenden kernhaltigen Zellen grün und alle toten kernhaltigen Zellen rot fluoreszieren.

Da reife rote Blutkörperchen von Säugetieren keine Zellkerne enthalten, erzeugen nur lebende und tote mononukleäre Zellen ein Fluoreszenzsignal. Die Erythrozyten müssen nicht lysiert werden, was Zeit spart und einen zusätzlichen Probenvorbereitungsschritt überflüssig macht.

Für die AO/PI-Färbung und die Bestimmung der Lebensfähigkeit werden 20 µl der Lebendzellprobe und 20 µl der AO/PI-Färbelösung kombiniert. 20 µl der gefärbten Probe werden dann in eine Cellometer-Zählkammer gegeben und in <60 Sekunden mit einem fluoreszierenden Cellometer-Instrument analysiert. Jedes Gerät meldet automatisch die Anzahl der lebenden/toten Zellen, die Konzentration der lebenden/toten Zellen, den mittleren Durchmesser und die prozentuale Lebensfähigkeit für die getestete Probe.

ViaStain™ Calcein AM

Calcein AM (Calcein-Acetoxymethylester) ist eine zellpermeable, nicht fluoreszierende Verbindung. Nach dem Passieren der Zellmembran wird Calcein-AM in lebenden Zellen schnell durch zelluläre Esterasen hydrolysiert. Die Hydrolyse spaltet die AM-Gruppe ab und wandelt das nicht fluoreszierende Calcein-AM in ein stark grün fluoreszierendes Calcein um. Da das entstandene Calcein hydrophiler ist, wird es im Inneren der Zellen mit intakten Membranen eingeschlossen. Zellen, die keine aktiven zytoplasmatischen Esterasen besitzen, sind nicht in der Lage, Calcein AM in Calcein umzuwandeln, und fluoreszieren daher nicht grün. Dies ermöglicht eine schnelle und einfache Detektion von stoffwechselaktiven Zellen in einer Probe.

Da Calcein-AM keine DNA-Bindung benötigt, färbt es alle stoffwechselaktiven Zellen und kann zur Messung der Stoffwechselaktivität in nicht kernhaltigen Zellen, wie z. B. Thrombozyten, verwendet werden. Da Calcein-AM photostabil ist, eine geringe Zytotoxizität aufweist und die Zellfunktionen nicht beeinträchtigt, ist es eine beliebte Färbung für die Untersuchung von Zellvitalität und Stoffwechselaktivität.

ViaStain™ Calcein-AM / PI Cell Viability Kit

Das Nexcelom Calcein-AM/PI Cell Vitality and Viability Kit ermöglicht die Messung der Anzahl und Konzentration sowohl der stoffwechselaktiven als auch der toten bzw. nicht lebensfähigen Zellen in einer Population. Die Software berechnet automatisch die prozentuale Vitalität/Viabilität basierend auf der Anzahl der Calcein-positiven (stoffwechselaktiven) Zellen und der Anzahl der PI-positiven (nicht lebensfähigen) Zellen.

Assay-Prinzip

Acetoxymethylester von Calcein (Calcein-AM) ist ein nicht fluoreszierender Farbstoff, der passiv in Zellen eindringt. In metabolisch aktiven Zellen wird der Farbstoff durch zytosolische Esterasen in grün fluoreszierendes Calcein umgewandelt. Das fluoreszierende Calcein wird von Zellen mit intakten Membranen zurückgehalten. Metabolisch aktive Zellen fluoreszieren im grünen Kanal. Propidiumjodid (PI) ist ein DNA-bindender Farbstoff, der in Zellen mit kompromittierten Membranen eindringt. Tote (kompromittierte) kernhaltige Zellen fluoreszieren im roten Kanal.